Методика исследований

Описание радиоиммунологического анализа

С целью определения гормонов в крови на современном этапе применяются различные методики. Каждая методика имеет свои недостатки и преимущества и используется с максимальной эффективностью. Так, с помощью биологических методик, как правило, можно определить наличие вещества, но нельзя сделать его количественную оценку. Такую возможность дают количественные иммунохимические и неиммунохимические методы анализа.

В нашей лаборатории применяется один из самых популярных в эндокринологии и онкологии методов – твердофазный радиоиммунологический анализ (РИА). С помощью РИА в биологических жидкостях определяют концентрации гормонов, факторов роста, ферментов, аутоантител, маркеров злокачественных новообразований и других веществ (например, лекарственных средств и наркотиков).

Принцип, используемый в РИА, распространяется и на другие иммунохимические и неиммунохимические методы анализа – принцип конкурентного связывания. Так, в иммуноферментном анализе (ИФА) вместо радиоактивного изотопа в качестве метки используют ферменты, а в иммунофлюориметрическом – флуоресцирующие вещества. В неиммунохимических методах роль антител выполняют реагенты, специфически связывающие определяемое вещество. Этими реагентами могут быть рецепторы гормонов или связывающие белки плазмы.

В основе РИА лежит феномен конкуренции: связывание антител с антигеном, меченным радиоактивным изотопом, подавляется в присутствии немеченого антигена.

Методика РИА проста и включает следующие основные этапы:

  1. К антителам добавляют меченый антиген и пробу (содержащую неизвестное количество немеченого антигена). Концентрацию антител в реакционной смеси подбирают так, чтобы число мест связывания было намного меньше общего числа антигенов. Концентрация меченого антигена должна превышать максимально возможную концентрацию антигена в пробе.
  2. Реакционную смесь инкубируют при определенной температуре заданное время. Меченный и немеченый антигены конкурентно связываются с антителами, при этом образуются иммунные комплексы, содержащие либо меченный, либо немеченый антиген. Таким образом, к концу инкубации в реакционной смеси присутствуют меченные и немеченые иммунные комплексы, а также свободные меченные и немеченые антигены. Количество меченных иммунных комплексов обратно пропорционально количеству немеченого антигена в пробе.
  3. Чтобы оценить количество образовавшихся меченных иммунных комплексов, их отделяют от оставшегося несвязанным свободного меченого антигена.
  4. Определяют концентрацию антигена в пробе по калибровочной кривой. Для ее построения используют несколько стандартных калибровочных растворов с известными концентрациями немеченого антигена.

Разработано множество вариантов РИА. Методика, описанная выше, называется твердофазным РИА. Это сравнительно молодая методика. Ранее применялась более трудоемкая и долгая в постановке жидкофазная РИА (все реагенты находились в растворенном состоянии). Особая разновидность метода – иммунорадиометрический анализ (ИРМА), в котором используются меченые антитела, в отличие от РИА, где используются меченые антигены.

Преимуществом практически всех RIA наборов является проведение анализа без предварительного разведения анализируемых проб. Таким образом, при достаточно широком диапазоне определяемых концентраций исключается дополнительный источник

Следует также учесть, что ферментативная реакция (ИФА) сильно зависит от температуры, времени, pH, качества воды, степени попадания прямого света. Поэтому хорошие результаты с ИФА достигаются при использовании полностью автоматизированных (в большинстве закрытых) анализаторов, исключающих возможные неточности в процедуре анализа. Однако такие анализаторы очень дороги и ставят потребителя в зависимость от определенной фирмы.

В настоящее время, сравнивая качество, получаемых методом РИА результатов, рядом достоин стоять лишь хемилюминесцентный или флуоресцентный анализ. Главным же недостатком хемилюминесцентных систем является их ориентация на закрытые автоматические анализаторы, что, несомненно, сказывается на стоимости анализа (в среднем в 2 раза выше, чем РИА методика).

Подведем итоги.

Преимущества РИА по сравнению с другими биологическими и биохимическими методами:

  • высокая чувствительность, позволяющая определять малые количества вещества (10 -10 г/мл)
  • высокая специфичность, обусловленная принципом иммунологических (антиген-антитело) реакций;
  • высокая точность и воспроизводимость метода;
  • простота выполнения анализа и значительная пропускная способность, дающая возможность проводить без особых трудностей большое количества проб;
  • отсутствие лучевой нагрузки на больного.

Заключение.

Роль РИА и других иммунохимических методов в диагностике болезней и в фундаментальных медико-биологических исследованиях трудно переоценить. Несомненно, при планировании и оценке результатов иммунохимических исследований надо принимать во внимание все их особенности и тонкости и ставить диагностические задачи с учетом реальных возможностей метода.