Методика досліджень

Опис радіоімунологічного аналізу

З метою визначення гормонів в крові на сучасному етапі застосовуються різні методики. Кожна методика має свої недоліки і переваги і використовується з максимальною ефективністю. Так, за допомогою біологічних методик, як правило, можна визначити наявність речовини, але не можна зробити його кількісну оцінку. Таку можливість дають кількісні імунохімічні і неімунохімічні методи аналізу.

У нашій лабораторії застосовується один з найпопулярніших в ендокринології та онкології методів – твердофазний радіоімунологічний аналіз (РІА). За допомогою РІА в біологічних рідинах визначають концентрації гормонів, факторів росту, ферментів, аутоантитіл, маркерів злоякісних новоутворень та інших речовин (наприклад, лікарських засобів і наркотиків).

Принцип, який використовується в РІА, поширюється і на інші імунохімічні і неімунохімічні методи аналізу – принцип конкурентного зв’язування. Так, в імуноферментному аналізі (ІФА) замість радіоактивного ізотопу в якості мітки використовують ферменти, а в іммунофлюоріметріческом – флуоресцентні речовини. У неімунохімічних методах роль антитіл виконують реагенти, які специфічно зв’язують визначаєму речовину. Цими реагентами можуть бути рецептори гормонів або зв’язуючі білки плазми.

В основі РІА лежить феномен конкуренції: зв’язування антитіл з антигеном, міченим радіоактивним ізотопом, пригнічується в присутності неміченого антигену.

Методика РІА проста і включає наступні основні етапи:

  1. До антитіл додають мічений антиген і пробу (яка містить невідому кількість неміченого антигену). Концентрацію антитіл в реакційній суміші підбирають так, щоб число місць зв’язування було набагато менше загального числа антигенів. Концентрація міченого антигену повинна перевищувати максимально можливу концентрацію антигену в пробі.
  2. Реакційну суміш інкубують при певній температурі заданий час. Мічений і немічений антигени конкурентно зв’язуються з антитілами, при цьому утворюються імунні комплекси, що містять або мічений, або немічений антиген. Таким чином, до кінця інкубації в реакційній суміші присутні мічені і немічені імунні комплекси, а також вільні мічені і немічені антигени. Кількість мічених імунних комплексів обернено пропорційно кількості немічених антигену в пробі.
  3. Щоб оцінити кількість утворених мічених імунних комплексів, їх відділяють від решти непов’язаним вільного міченого антигену.
  4. Визначають концентрацію антигену в пробі по калібрувальній кривій. Для її побудови використовують кілька стандартних калібрувальних розчинів з відомими концентраціями немічених антигенів.

Розроблено безліч варіантів РІА. Методика, описана вище, називається твердофазним РІА. Це порівняно молода методика. Раніше застосовувалася більш трудомістка і довга в постановці Рідкофазний РІА (всі реагенти знаходилися в розчиненому стані). Особливий різновид методу – імунорадіометрічний аналіз (ИРМА), в якому використовуються мічені антитіла, на відміну від RIA, де використовуються мічені антигени.

Перевагою практично всіх RIA наборів є проведення аналізу без попереднього розведення аналізованих проб. Таким чином, при досить широкому діапазоні концентрацій які визначаються виключається додаткове джерело

Слід також врахувати, що ферментативна реакція (ІФА) сильно залежить від температури, часу, pH, якості води, ступеня попадання прямого світла. Тому хороші результати з ІФА досягаються при використанні повністю автоматизованих (в більшості закритих) аналізаторів, що виключають можливі неточності в процедурі аналізу. Однак такі аналізатори дуже дороги і ставлять споживача у залежність від певної фірми.

В даний час, порівнюючи якість, одержуваних методом РІА результатів, поруч гідний стояти лише хемілюмінесцентний або флуоресцентний аналіз. Головним же недоліком хемілюмінесцентних систем є їх орієнтація на закриті автоматичні аналізатори, що, безсумнівно, позначається на вартості аналізу (в середньому в 2 рази вище, ніж РІА методика).

Підведемо підсумки.

Переваги РІА порівняно з іншими біологічними і біохімічними методами:

  • висока чутливість, що дозволяє визначати малі кількості речовини
  • висока специфічність, зумовлена принципом імунологічних (антиген-антитіл) реакцій;
  • висока точність і відтворюваність методу;
  • простота виконання аналізу і значна пропускна здатність, що дає можливість проводити без особливих труднощів великі кількості проб;
  • відсутність променевого навантаження на хворого.

Висновок.

Роль РІА та інших імунохімічних методів в діагностиці хвороб і в фундаментальних медико-біологічних дослідженнях важко переоцінити. Безсумнівно, при плануванні та оцінці результатів імунохімічних досліджень треба брати до уваги всі їхні особливості і тонкощі і ставити діагностичні завдання з урахуванням реальних можливостей методу.